• 3D動態灌流培養:構建更真實的細胞體外生長環境

    2020.04.27你知道嗎

     

    細胞培養作為現代生物醫學研究的基本技術方法和一些生物制品的生產手段,其技術手段也得到了不斷發展。


    傳統的二維(2D)細胞培養因其經濟、便利、容易操作等特點被廣泛應用,在生物醫學等各領域發揮了重要作用。然而,二維培養的缺陷是細胞生存的環境與自然狀態下體內三維環境的差異巨大,導致其形態、生理功能、藥物反應等條件的改變。

    向3D培養方式轉變

    為了解決這些問題,近20多年來科學家們開發了許多三維(3D)細胞培養模型來滿足不同的應用。三維細胞培養(Three-Dimensional Cell Culture)即將細胞培養于具有三維結構的載體,使細胞在載體的三維空間結構中遷移、生長,形成細胞-載體三維復合物,以利于更好地模擬體內細胞微環境。3D細胞培養可分為支架三維培養(scaffold-based)和無支架三維細胞培養(scaffold-free)兩種方式。

     

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    體外3D細胞培養最關鍵的特征是,能夠最大程度為細胞提供合適的生長微環境,并在體外創造組織樣結構的能力,模擬體內特定的細胞行為。越來越多的證據表明,3D細胞培養可以建立起生理上的細胞-細胞與細胞-細胞外基質相互作用,從而可以模擬天然組織的特異性,其生理相關性顯著強于傳統的2D細胞培養。有學者認為,3D細胞培養顯著優于2D培養方式,3D細胞培養對新藥物開發、疾病模型建立、干細胞應用以及器官移植等方面可能會徹底改變原有方式。

    灌流培養的應用


    為了維持最佳的細胞生長環境,借鑒在大型化生物工程產業中提高蛋白質等代謝產物的產量而發展起來的灌流培養(perfusion culture)方式,開始應用于實驗室研究中。通過灌流培養,在細胞培養過程中,不斷地將部分培養基取出,同時又連續不斷地灌注新的培養基,可為細胞提供更好的營養環境,促進細胞生長,實現長期培養,維持細胞與組織功能,并為進一步分化等生長提供良好條件。

     

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    實際情況下,許多細胞都暴露于由生物流體系統所產生的流體剪切應力中,這些機械力對細胞的生長、形態具有重要影響。因此,動態灌流培養模式還可通過調節流速,模擬類似于體內的流體剪切力環境,對于細胞的培養和研究也更加全面和具體。如內皮細胞的培養,適當的剪切力有利于促進其規范化的排布;干細胞培養則需要低剪切力環境避免刺激其分化。

    另一方面,目前3D細胞培養還面臨克服營養供給的難題。靜態培養下培養液的組織滲透深度有限,約200μm以內。因此僅把具有3D結構的類組織體浸沒于培養液中靜態維持,沒有流動的血液和血流的通道或液流的動力,類組織體結構中的細胞仍然難以獲得足夠的營養,難以實現在體外較長時間的維持。動態灌流培養方式,不僅能實現營養物質充足、均勻的滲透,還可避免3D打印結構體在靜態培養條件下從外向內容易出現梯度效應所形成的培養條件不均的現象。

     

    CASE01
    3D打印膠原PCL支架軟骨再生靜態培養與灌流培養評價


    該項研究中,采用兩種不同的分化培養基(StemPro、TGF-β2),分別在凝膠化和非凝膠化PCL支架,靜態和灌流生物反應器動態培養條件下,進行軟骨分化實驗比較。結果顯示,動態培養結合TGF-β2培養基有利于軟骨形成。

     

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    靜態培養的細胞在支架上生長良好,但在支架內的滲透性有限,因此不能完全滿足三維培養的目的,相比之下動態培養能使細胞在支架內更好地滲透和均勻分布。在動態培養中,非凝膠支架與內部TGF-β2培養基相結合,增強了軟骨分化性能。

    Konstantinos Theodoridis, Aristeidis Kritis, et al. Assessment of cartilage regeneration on 3D collagen-polycaprolactone scaffolds: Evaluation of growth media in static and in perfusion bioreactor dynamic culture[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2019.
    (https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2019.110403)

    CASE02
    去細胞化肝支架灌流培養構建竇狀微血管


    去細胞化肝移植支架血管網生成是阻礙可移植肝移植發展的主要障礙。在該研究中,研究人員假設機械因素(如流體剪切應力)和化學因素(如纖維連接蛋白涂層)都能促進包括竇狀微血管在內的分層血管網絡的形成,分別采用靜態培養、不同流速的灌流培養、經50μg/ml纖維連接蛋白浸泡處理的灌流培養三種培養方式比較血管生成情況。

     

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    結果表明,灌流培養促進了肝支架內竇狀微血管的形成,而靜態培養則沒有觀察到。尤其是4.7?ml/min的灌流培養效果相對比2.4?ml/min和9.4?ml/min的灌流培養更為理想。在灌流培養中觀察到排列良好的內皮細胞,這表明內皮細胞感受到了流動誘導的剪切應力。此外,纖維連接蛋白涂層在4.7?ml/min的灌流培養中也促進了竇狀微血管的形成。這項研究不僅為肝移植進展也為藥物篩選和疾病模型研究提供了一定的指導意義。

    Masafumi Watanabe, Ryo Sudo, et al. Construction of sinusoid-scale microvessels in perfusion culture of a decellularized liver[J]. Acta Biomaterialia, 2019.
    (https://doi.org/10.1016/j.actbio.2018.12.042)



    實驗室3D動態灌流培養解決方案


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    3D動態灌流培養系統


    現有的三維灌流培養裝置大多都是較大型的生物反應器,而且需要專業的技術和特殊的培養載體,對實驗研究和初步開發就不完全適用。同時隨著生物3D打印等技術應用的興起,科研工作中對個性化小型動態灌流培養系統的需求逐漸突顯。


    為更好的服務研究工作深層次開展,邁普醫學自主研發推出適用于實驗室的小型化3D動態灌流培養系統。設備主要由儲液部(瓶)、動力源,以及灌流槽三部分構成。培養開啟時,培養液循環流入灌流槽內,形成閉環的循環回路,為細胞培養提供充足的營養物質,同時及時帶走細胞代謝廢物,解決靜態培養代謝廢物排除、營養滲透不均的問題,實現體外生物制造類組織結構體的長期體外培養,并維持較高的細胞活性。  


    此3D動態灌流培養系統結構簡單小巧,可置于普通二氧化碳培養箱中使用;灌流培養流速、流量、壓力等可調節,形成不同流體剪切應力環境適應不同類型細胞培養;支持并聯或串聯多個灌流槽,進行連續、長期的動態循環灌流培養,培養情況可即時通過顯微鏡觀察。設備適用于幾乎任何類型細胞的3D培養包括原代細胞、細胞系、干細胞及多種細胞共培養,可廣泛應用于組織工程及再生醫學、腫瘤、細胞學以及藥物研發等多個領域的各實驗室研究項目中。


    - Joseph, J. S., et al. Two-dimensional(2D) and three-dimensional(3D) cell culturing in drug discovery[M]. Cell Culture: IntechOpen, 2018.
    - Caleb Jensen, and Yong Teng. Is It Time to Start Transitioning From 2D to 3D Cell Culture?[J]. Frontiers in Molecular Biosciences, 2020.
    - Bhaskar Birru, et al. Mechanistic role of perfusion culture on bone regeneration[J]. Journal of Biosciences, 2019.

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